Effect of nanoparticles on the gene expression of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa, yanık hastaları ve bağışıklık sistemi zayıf olan kişiler arasında hastalık ve ölüme neden olan birincil faktördür. P. aeruginosa enfeksiyonlarıyla mücadelede yeni yollar sunan alternatif tedavi yaklaşımlarının araştırılmasına ve geliştirilmesine yönelik artan bir ihtiyaç vardır. Bu araştırma alanına yönelik ilginin artmasıyla birlikte bu talep sürekli olarak artmaktadır. Bu çalışma, Bağdat'taki dört hastanede farklı enfeksiyonlara sahip hastalardan toplanan ve P. aeruginosa'nın izolasyonu ve tanımlanması için Cetrimide agar, Blood agar ve MacConkey agar plaklarında kültürlenen 120 klinik örneği içermektedir. Morfolojik ve biyokimyasal testlere göre tüm örneklerde 55 adet Pseudomonas aeruginosa izolatı (%45,8) tespit edilmiştir. Bu izolatların prevalansı kadın hastalarda 28 (%50,9) iken erkek hastalarda 27 (%49,0) olarak tespit edilmiş; bakteriyel enfeksiyon oranının en yüksek olduğu yaş grubu 31 (20-30 yaş), bunu sırasıyla 12 (31-40 yaş), 10 (41-50 yaş) ve 2 (61-70 yaş) takip etmiştir. Bu çalışmada mikrotitre plak yöntemiyle biyofilm oluşumu sonuçları, 55 izolattan 10'unun (%18,2) güçlü biyofilm üreticisi olduğu bulunmuştur. Ayrıca izolatların 21'inin (%38,2) orta derecede biyofilm üreticisi olduğu, diğer izolatların (n=24; %43,6) biyofilm üretimi açısından zayıf olduğu tespit edilmiştir. Çinko oksit nanopartiküllerinin kullanıma sunulmasından önce, P. aeruginosa'nın çinko oksit nanopartiküllerinin sonradan eklenmesiyle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha fazla (p<0.01) biyofilm oluşumu gözlenmiştir. Disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapılan antibiyotik duyarlılık testi sonuçları, bu çalışmaya dahil edilen tüm P. aeruginosa izolatları arasında antibiyotik direncinde farklılıklar olduğunu ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışmanın bulgularına göre Levofloksasin, Ceftazidime, İmipenem, Tobramisin ve Aztreonam antibiyotikleri sırasıyla %89, %89, %80, %73 ve %71 ile antibiyotiklere karşı en yüksek dirence sahipti. P. aeruginosa izolatları bu çalışmada kullanılan güçlü, orta ve zayıf biyofilmdi ve P. aeruginosa'nın temizlik geni olarak rspL geni kullanılarak PCR tekniği ile tespit edilmiştir. Test edilen P. aeruginosa'nın tümü klinik olarak rspL genini içermektedir. Sonuçlar, son genin güçlü biyofilm üreten izolatların %80'inde bulunduğunu, rhlI geninin ise tüm güçlü biyofilm izolatlarında bulunduğunu göstermiştir. 55 izolattan 10 izolat güçlü biyofilm üreticileri olarak ve 8'i her iki lasI genini de (%80) içerirken, tüm bu izolatlarda rhlI bulunmuştur. Kantitatif PCR reaksiyon deneyi, her biri iki biyofilm geni içeren, Pseudomonas aeruginosa'nın altı adet oldukça yetkin biyofilm üreticisi izolatını içermektedir. Bu izolatlar, ZnO-np'ye göre değişen alt MİK değerleri ile bilinçli olarak seçilmiştir. Bu çalışmada, biyofilm genlerinin mRNA ekspresyonu, bakteriyel büyüme sırasında her bir numune için minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) altındaki konsantrasyonlar kullanılarak ZnO-np ile tedavi edilen numuneler ile tedavi edilmeyen numuneler karşılaştırılarak kantitatif bir RT-PCR tahlili yoluyla incelenmiştir. Sonuçlar, ZnO-np varlığında biyofilm genlerinde önemli bir aşağı regülasyon olduğunu ortaya çıkarmıştır. Sonuçlar, ZnO-np tedavisi öncesinde ve sonrasında test edilen tüm izolatları içeren Pearson korelasyon analizi kullanılarak RSPL, lasI ve rhlI genlerinin gen ekspresyonu ile biyofilm oluşumu arasında anlamlı bir pozitif korelasyon olduğunu göstermiştir.

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen, is a primary contributor to illness and death among burn patients and individuals with compromised immune systems. There is a growing need for the exploration and advancement of alternative therapeutic approaches that offer fresh avenues to combat P. aeruginosa infections. This demand is continuously increasing, with heightened attention directed towards this area of research. This study included One hundred and twenty clinical specimens collected from patients with different infections from four hospitals in Baghdad, which were cultured on Cetrimide agar, Blood agar, and MacConkey agar plates for isolation and identification of P. aeruginosa. According to morphological and biochemical tests, 55 Pseudomonas aeruginosa isolates (45.8%) were found in all samples. The prevalence of these isolates was 28 (50.9%) in female patients, compared to 27 (49.0%) in male patients, as shown in table (4-1); the highest rate of bacterial infection was within the age group 31 (20-30 year), followed by 12 (31-40 year), 10 (41-50 year), and 2 (61-70 year) respectively. In the present study, results of biofilm formation by the microtiter plate method showed that ten isolates from 55 isolates (18.2%) were strong biofilm producers. Also, it was found that 21(38.2%) isolates were moderate biofilm producers, and the other isolates (n=24; 43.6%) were weak to produce the biofilm Prior to the introduction of Zinc oxide nanoparticles, Pseudomonas aeruginosa exhibited a considerably greater (p<0.01) biofilm formation compared to the post-addition of Zinc oxide nanoparticles. The results of the antibiotic susceptibility test, conducted using the disc diffusion method, revealed variations in antibiotic resistance among all P. aeruginosa isolates included in this study. According to the findings of this study, the antibiotics Levofloxacin, Ceftazidime, Imipenem, Tobramycin, and Aztreonam had the highest resistance to antibiotics: 89%, 89%, 80%, 73%, and 71% respectively. The isolates of P. aeruginosa were the strong, moderate, and weak biofilm used in this study and detected by PCR technique using the rspL gene as the housekeeping gene of P. aeruginosa. All the tested P. aeruginosa clinically contained the rspL gene. The results showed that the last gene was found in 80% of isolates that produce strong biofilm, while the rhlI gene was found in all potent biofilm isolates. Ten isolates from 55 isolates were potent biofilm producers, and 8 contained both lasI genes (80%), while rhlI was found in all these isolates. The quantitative PCR reaction experiment involved six highly proficient biofilm producer isolates of Pseudomonas aeruginosa, each containing two biofilm genes. These isolates were deliberately selected with varying sub-MIC values to ZnO-np. In this study, the mRNA expression of biofilm genes was examined through a quantitative RT-PCR assay, comparing the samples treated with ZnO-np to those left untreated, using concentrations below the minimum inhibitory concentration (MIC) for each sample during bacterial growth. The results revealed a significant down-regulation in biofilm genes in the present of ZnO-np. The results showed a significant positive correlation between gene expression of RSPL, lasI, and rhlI genes and biofilm formation using Pearson correlation analysis which included all the tested isolates before and after the treatment with ZnO-np.