Molecular cloning, heterologus expression, and structural modeling of L-asparaginase from Pseudopedobacter saltans in e.coli

Abstract

L-asparaginaz (L-ASP) veya l-Asparagin aminohidrolaz (EC 3.5.1.1), L-Asn'yi aspartik asit ve amonyağa hidrolize edebilen hidrolazlar sınıfına ait bir enzimdir. Su kullanımı yoluyla amino asit asparajinin bölünmesini destekleyen ve peptit olmayan karbon-azot bağlarını parçalayan akut lenfoid lösemi tedavisinde kullanılır. Bu güncel çalışmada, yeni L-asparaginaz geninin klonlanması, E. coli'de Pseudopedobacter saltans DM12145'ten yapılmıştır. Yeni bakteri Pseudopedobacter Saltans'ın DM12145'in, L-asparaginaz genine sahip olduğunun belirlenmesiyle ilgili tüm genetik bilgileri, BLAST web sitesi NCBI'den (//www.ncbi.nlm.nih.gov) elde edilmiştir. Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz'ın tam uzunluğu 1019 bp'dir ve moleküler ağırlığı, 37.8 kDa olarak değerlendirilmiştir. PCR, GenBank'ta belirtildiği gibi tam bir açık okuma çerçevesi ORF'si ile nükleotid dizileri [(ileri) 5'-ATCGGATCCATCACCATT-3' ve (geri) 3'-GCGAAGTTTAGTTAGATGATGATT-5'] ile ileri ve geri primerler kullanılarak kodlanmıştır. Pseudopedobacter saltans DSM 12145'ten L-asparaginaz gen tip I'i kodlayan bu açık okuma çerçevesi (ORF), NC_015177.1 erişim numarasıyla Pseudopedobacter saltans DSM 12145 genomundaki 4301275-4302294 nükleotidden yayılmıştır. L-asparaginaz tip I geninin bu nükleotid dizisi, Genscript Co., ABD tarafından EZ Clone yöntemiyle sentezlendi. Protein ID: (WP_013634621.1") ile 1019 bp'ye sahiptir. pET-28a (+) ekspresyon vektörü üzerine klonlandı. Yapı, pET-28a (+)/asp_pseudopedo olarak aday gösterildi. Rekombinant L-asparaginaz'ın başlangıç seviyesi, E. coli BL21 (DE3) Rosetta suşunda 6 His etiketli bir füzyon proteini olarak ifade edildi. pET-28 His (+)/L-asparaginaz yapısını barındıran 0.0003 U/mL idi. Uygulanan optimize edilmiş strateji, LB büyüme ortamının ikame edilmesi üzerine rekombinant Rosetta suşunun hücre lizatında izlenen L-asparaginaz aktivitesini başarılı bir şekilde arttırdı. Transformasyon koşulu, ilgili antibiyotik kanamisin (34 g/mL) ile LB agar ortamı üzerinde kültürlendi ve gece boyunca 37 °C'de ve 200 rpm'de 0.5 ila 600 nm'lik bir optimal yoğunluk ulaşana kadar inkübe edildi. Ekspresyon indüksiyonu, 1 mM IPTG (izopropil-D-tiogalaktopiranoz) kullanılarak kültür ortamının 200 rpm'lik bir çalkalama hızıyla 30°C'de 18 saat inkübe edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Ertesi gün, GeneJET plazmit mini hazırlık kiti (Thermo-Fisher "Co." ABD) kullanılarak üç kültürden plazmit mini hazırlık yapıldı. Tek bir koloniden kaynaklanan saf bir kültürden izole edilen her plazmit, eklenen L-asparaginaz tip I geninin amplifikasyonu için MluI ve XhoI ve PCR kullanılarak kısıtlama sindirimine tabi tutuldu. İzole edilen DNA plazmitleri, pET-28a (+) vektörü üzerinde Pseudopedobacter saltans'tan L-asparaginaz tip I geninin varlığını kanıtlamak için PCR şablonları olarak kullanıldı. PCR reaksiyonu, pET-28a (+) vektörü T7 promotör /T7 terminatörün evrensel primer seti ile gerçekleştirildi. Evrensel primer seti T7 promotör /T7 terminatörünün dizisi aşağıdaki gibidir: T7 promotörü (5'-TAATACGACTCACTATAG-3'), T7 terminatörü (5'-TAATTGCTCAGGTGG-3'). Amplifiye edilmiş genomik PCR ürününün (1500 bp) beklenen boyutu, Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz tip I genini (1019 bp) içerir. Bununla birlikte, evrensel primer seti T7 promotörü ve T7 terminatörü, ekin (Pseudopedobacter saltans'tan L-asparaginaz gen tip I) başlangıcından ve sonundan uzak olduğu sürece, PCR ürünündeki ekstra uzunluk vektöründen kaynaklanmakatadır. Bu nedenle, amplifiye edilmiş genomik ürünün, yaklaşık 1500 bp'lik L-asparaginaz I geninden biraz daha büyük bir boyuta sahip olması ve kalan ekstra nükleotidin vektörün kendisinden olması beklenir. Genomik dizilemeden sonra doğru nükleotid dizisi doğrulandı. Sonuç olarak, Pseudopedobacter saltans'tan elde edilen L-asparaginaz geninin rekombinant proteini, ardışık 6 histidinden (6xHis) oluşan bir kuyruk (etiket) ile N-terminal kısmında eksprese edildi. İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile saflaştırma yöntemi olarak yaygın olarak kullanılan basit bir etikettir. Bu kuyruğun (etiket) kullanımı, eksprese edilen protein ile kromatografik kolon (verimi artıran) arasında doğrudan etkileşimden kaçınmanın yanı sıra, üretim maliyetinden tasarruf (tek aşamalı saflaştırma) sağladığı için protein üretim adımında avantajlar sağlar. çünkü sadece His-tag, kromatografik reçineyi oluşturan mikro kürelerde tutulan Ni2+ ve Co2+ metalik iyonları ile etkileşime girer. Rekombinant L-asparaginazın saflaştırma işlemi için, 3 yıkama tamponu (300 mM NaCl, Gliserol %5 ve 25-, 50- ve 100-mM imidazol içeren 50-mM Tris) ve bir elüsyon tamponu (300 mM NaCl, Gliserol) %5 ve 50-mM Tris ve 250 mM imidazol) hazırlandı. Her ikisi de nikel iyonu (Ni+) ile konjuge edilmiş agarozdan oluşan HisTrapTM HP kolonu kullanılarak pH 8.0'da hazırlandı. IMAC Kromatografisi ile protein saflaştırmasından sonra, rekombinant protein, çözünürlüğünü değerlendirmek ve aynı zamanda rekombinant proteinin moleküler ağırlığını (M.W) belirlemek için Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edildi. Pseudopedobacter saltans protein L-asparaginaz I enziminin beklenen molekül ağırlığı 37.8 kD'dir. SDS-PAGE analizi, protein bandının boyutunun 36.0 kDa'da tam olarak beklendiği gibi olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle, asp_pseudopedo'nun rekombinant proteini, çözünür fraksiyonda eksprese edildi ve enzimatik aktivitesini korudu. L-asparaginaz, L-asparagine etki ettiğinde, amonyak açığa çıkar ve alkali koşullarda Fenol Red'in sarı renginin pembeye dönmesine neden olur. Asp_pseudopedo enziminin aktivitesi üzerindeki pH varyasyonunun neden olduğu etkinin değerlendirilmesi, pH 3 ila 11 arasında değişen farklı tamponlar (Sitrat tamponu (0.2 mM)-fosfat (0.1 mM)- Tris tamponu (50 mM) ve Glisin tamponu) kullanılarak kolorimetrik Nesslerizasyon yöntemine dayalı olarak gerçekleştirilmiştir. Test, 20 °C ila 90 °C arasında değişen bir sıcaklık yükselme rampası ile asp_pseudopedo'nun enzimatik aktivitesi için optimum sıcaklığı belirler. Varyasyonu 62.5 M ila 9.91 mM arasında değişen kademeli L-asparagin konsantrasyonları ile asp_pseudo enziminin kinetik mekanizması değerlendirildi. Elde edilen veriler, asp_pseudopedo enziminin optimal pH'ı 8,0 ve maksimum aktivite sıcaklığının 60 oC olduğunu, değişken kinetik Km değeri 3 mM ve Vmax'ın 168,2 mol/dak/mg olduğunu ortaya koyan kinetik parametreleri belirlemek için SigrafW programında kullanıldı. Silico analizi, filogenetik Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz geninin ağacını oluşturmak için Phylogeny.fr yazılımı [91]. Kullanılarak yapıldı. İkincil yapının tahmini, SAS online programına (yapıya göre açıklamalı dizi) göre yapıldı [92]. Daha sonra, verileri elde etmek için proteinin sekansı SWISS-MODEL sunucusuna gönderilerek boyutsal yapı beklentisi yapılmış ve PDB görüntüleyici programı kullanılarak 3 boyutlu yapısal tahmin analiz edilmiştir. BLASTP benzerlik dizisi araştırması, diğer farklı L-asparaginazların ve Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz genlerinin protein dizileri arasında %99.34-91.84 arasında değişen yüksek bir dizi özdeşliği sağladı. Siliko analizinin sonucu, Pseudopedobacter saltans'tan elde edilen L-asparaginaz enziminin, L-asparajin için belirgin bir şekilde spesifik olan ve homodimer sitozolik proteinler olarak işlev gören E. coli'nin L-asparaginaz I'ine oldukça benzer olduğunu ortaya koymaktadır. Siliko analizinin bulgularına göre, Pseudopedobacter saltans'tan elde edilen L-asparaginaz enzimi, E. coli'den elde edilen tip L-asparaginaz tip I genine oldukça benzerdir ve L-asparajin için belirgin bir şekilde spesifiktir ve homodimer sitozolik proteinler olarak işlev görür. Bu, sitozolde bulunan ve çözelti içinde bir homodimer olarak hareket eden L-Asparajin'e belirgin bir şekilde özgüdür. Sonuçlarımız, bildirilen diğer çalışmalarla uyumludur, örneğin, E. coli L-asparaginaz tip I Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz I, Vibrio cholerae L-asparaginase ile yaklaşık (%99) ve yaklaşık (%92) Yersinia pseudotuberculosis ve Escherichia coli L-asparaginaz enzimi tip I ile benzerlik gösterir. Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz, değişmez amino asit kalıntıları ile karakterize edilen, mikrobiyal L-asparaginaz için ortak olarak korunmuş benzersiz imzasıyla sınıflandırılır; Thr12, Ala23, Lys25, Ser88, Asp89, Lys165, Leu291, katalize dahildir. Ayrıca, Pseudopedobacter saltans L-glutaminaz I'e L-asparaginaz katalitik tortusu, amino asit tortuları; Thr12, Ala23, Ser88, Glu286, Leu291. Son olarak, çözünür ve aktif istatistiklerde yeni bir bakteriyel Pseudopedobacter saltans L-asparaginaz enziminin klonlanması ve ekspresyonu başarıyla sağlandı.

L-asparaginase (L-ASP), or l-Asparagine aminohydrolase (EC 3.5.1.1), is an enzyme that belongs to the class of hydrolases that is capable of hydrolyzing L-Asn into aspartic acid and ammonia, which is used in the treatment of acute lymphoid leukemia, which promotes the cleavage of the amino acid asparagine through the use of water and cleaves non-peptide carbon-nitrogen bonds. In this current study, cloning of the novel L-asparaginase gene from Pseudopedobacter saltans DM12145 was performed in E. coli with accession number NC_015177.1. The full-length of Pseudopedobacter saltans L-asparaginase is 1019bp, a protein-encoding 339 amino acids; and the molecular weight was evaluated to be 37.8 kDa, with a theoretical (pI) of 6.13. It was cloned on the expression vector pET-28-His (+) by the EZ Clone method, synonymously called ligation independent cloning (LIC) with protein ID WP_013634621.1 by Genscript Co., USA. It was cloned onto the expression vector pET-28a (+). The construct was nominated as pET-28a (+)/asp_pseudopedo. The recombinant L-asparaginase I gene of Pseudopedobacter saltans was expressed in pET28-His and transformed into E. coli BL21 (DE3) as a 6 His-tag fusion protein. Induced by one mM of IPTG for 18 h at 30 oC, and purified by IMAC chromatography, then analyzed by SDS-PAGE to assess the solubility and molecular weight of the recombinant protein band, which was exactly as expected at 36.0 kDa. The findings of this study reveal that the L-asparaginase I enzyme maintained its enzymatic activity at a pH of 8.0, the temperature of 60 oC, with a variable kinetics Km value equal to 3 mM and a Vmax of 168.2 mol/min/mg. The Silico analysis reveals that it is quite similar to L-asparaginases I of E. coli, which are distinctly specific for L-asparagine and act as homodimer cytosolic proteins. Finally, the cloning and expression of a novel-bacterial Pseudopedobacter saltans L-asparaginase enzyme in soluble and active stats were successfully achieved.