Gerçek Zamanlı Rt-Pcr Metodu ile Hıv-1proviral Dna Kantitasyonunun Optimizasyonunda Kullanılan Kantitasyon Standartlarının Genklonlama Teknolojisi İle Geliştirilmesi

Abstract

HIV-1 proviral DNA, retrovirüs olan HIV-1’in konak hücre genomuna entegre olmuşf ormunu temsil eder ve antiretroviral tedavi altındaki bireylerde viral kalıntının değerlendirilmesinde kritik bir biyo belirteçtir. Proviral DNA düzeylerinin doğru şekildekantitatif olarak belirlenmesi, viral rezervuarın takibi ve tedavi etkinliğinin değerlendirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, HIV-1 proviralDNA'nın PZR ile tespitinde testin kalite kontrolü amacıyla kullanılacak olan pozitif kontrolmateryalinin gen klonlama teknolojisi kullanılarak üretimi amaçlanmıştır. Çalışmada, HIV-1 genomunun yüksek düzeyde korunan Long Terminal Repeat (LTR) bölgesi konvansiyonelPCR ile çoğaltılmış, pJET1.2/blunt vektörüne klonlanmış ve elde edilen rekombinantplazmidin doğruluğu Sanger sekanslama ile teyit edilmiştir. Geliştirilen bu rekombinant standart materyal, gerçek zamanlı PCR uygulamaları için referans olarak kullanılmak üzeretasarlanmıştır. Çalışma kapsamında geliştirilen bu yerli ve özgün standart, hem düşükmaliyetli hem de yüksek çoğaltılabilirlik ve güvenilirlik özellikleri ile ön plana çıkmaktadır. Literatürde benzer çalışmalarla kıyaslandığında, LTR bölgesinin hedef olarak seçilmesisayesinde yüksek özgüllük sağlandığı, pJET1.2/blunt vektörünün pozitif seleksiyon özelliği sayesinde ise klonlama sürecinin kolaylaştırıldığı gözlemlenmiştir. Elde edilen bu standart materyalin, ilerleyen aşamalarda klinik örneklerde yapılacak validasyon çalışmalarıylabirlikte tanısal süreçlerde güvenilir şekilde kullanılabileceği öngörülmektedir.